Содержание страницы
Что такое фрагментация ДНК сперматозоидов?
Фрагментация ДНК сперматозоидов – это тип теста на мужскую фертильность, измеряющий количество поврежденной ДНК в образце спермы.
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) – это молекула, содержащая генетическую информацию и используемую в развитии и функционировании организмов, и присутствует во всех клетках человека, кроме эритроцитов.
В случае сперматозоида человека генетическая информация сохраняется в головке и, чтобы уместиться в такое маленькое пространство, нужны сложные механизмы, требующие замены одних молекул другими (в частности, гистоны заменяются протамином). Это приводит к высокой конденсации ДНК, которую легко защитить и транспортировать.
В последние годы растет интерес к целостности ДНК спермы и ее влиянию в случаях бесплодия, когда показатели обычной спермограммы нормальны. Были сделаны попытки оценивать этот параметр как новый метод для прогнозирования мужской репродуктивной способности и вместе с обычным анализом спермы (спермограммой) продолжить изучение мужского фактора бесплодия.
Целостность генетического материала сперматозоидов считается жизненно необходимой для нормального оплодотворения, должного развития эмбриона и успешной имплантации (прикрепления эмбриона к слизистой полости матки) развития беременности как при естественном оплодотворении, так и при вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ). У всех мужчин есть определенные повреждения ДНК спермы. Одноцепочечное повреждение включает многочисленные точки разрыва во всех областях генома, связанные с окислительным (оксидативным) стрессом; это может препятствовать клинической беременности и, как следствие, увеличению времени до зачатия ребенка. Напротив, двухцепочечные разрывы ДНК могут быть связаны с отсутствием репарации ДНК в клеточном мейозе, способствуя повышенному риску прерывания беременности, плохому качеству эмбриона и неудаче имплантации при лечении бесплодия [1].
Оксидативный стресс постоянно происходит в организме человека и может повреждать ДНК сперматозоидов. Факторы окружающей среды (пластик, растворители, консерванты, тяжелые металлы) и образ жизни (курение, чрезмерное употребление алкоголя, чрезмерное употребление кофеина, психотропные препараты, сильный длительный стресс) может выраженно увеличивать уровень оксидативного стресса и соответственно увеличивать повреждение (уровень фрагментации) ДНК мужских половых клеток.
В этой статье мы рассмотрим дополнительные сведения о фрагментации ДНК, как понять результаты и чем она отличается от других тестов на фертильность.
Проверка качества спермы
Десятилетиями тестирование мужской фертильности полагалось на базовый анализ спермы, изучающий концентрацию, морфологию и подвижность сперматозоидов, то есть на спермограмму. Тем не менее, около 30% из 5 миллионов мужчин в США, сталкивающихся с бесплодием, до сих пор не знают, почему они бесплодны. Анализ спермы оценивает базовые критерии, но не дает полной или прогнозной оценки мужской фертильности.
Сперматозоиды очень малы, но они несут огромное количество генетической информации в яйцеклетку. Хотя наше понимание повреждения ДНК спермы возросло, точная причина остается неизвестной. Одним из важных замечаний является то, что количество обнаруженных повреждений спермы не всегда коррелирует с результатами спермограммы. Другими словами, у вас может быть хорошая спермограмма, но иметь место значительные повреждения ДНК спермы.
Интересно, что яйцеклетка обладает определенной способностью восстанавливать поврежденную ДНК спермы во время оплодотворения. Однако ученые полагают, что порог повреждения ДНК может превышать способность яйцеклеток к восстановлению. Особенно в женском возрасте старше 40 лет [3].
Какие бывают показатели фрагментации ДНК?
a.) От отличного к хорошему (меньше или равно 15% DFI)
b.) От хорошего до удовлетворительного (более 15% до менее 25% DFI)
c.) Удовлетворительно плохо (больше или равно 25% до менее 50% DFI)
d.) Очень плохо (больше или равно 50% DFI)
Рис.1. Одно- и двухцепочечные разрывы ДНК
Какие методы диагностики фрагментации спермы?
Анализ структуры хроматина спермы (SCSA)
Было разработано множество тестов для определения повреждения ДНК спермы. Однако все они используют несколько разные процедуры и обеспечивают разные стандарты измерения. Тест SCSA подразумевает обработку спермы химическим красителем. Поврежденная ДНК становится красной, нормальная ДНК становится зеленой.
Рис.2 Метод SCSA, поврежденная ДНК красного цвета, неповрежденная – зеленого.
После этого образец пропускают через компьютеризированную машину со специальным программным обеспечением, считывающим около 5000 клеток спермы. Затем он классифицирует соотношение зеленых и красных сперматозоидов, чтобы определить индекс фрагментации ДНК (DFI). Вполне возможно, что тест SCSA может обнаружить повреждение в 20% пар, у которых раньше не было объяснений бесплодия.
Тест на дисперсию хроматина сперматозоидов (SCD)
SCD (sperm chromatin dispersion) – это простой и быстрый анализ, обнаруживающий фрагментацию ДНК спермы; это может быть выполнено без необходимости в сложном лабораторном оборудовании. Сперматозоиды с помощью агарозы прикрепляются к предметному стеклу, инкубируются с кислотным раствором, который денатурирует ДНК, а затем адаптированным лизирующим раствором, который удаляет большинство ядерных белков. В результате этого петли ДНК здоровых сперматозоидов образуют хроматиновые ореолы, а поврежденные (фрагментированные) не производят ореолов.
Рис.3. Метод SCD, сперматозоиды с неповрежденной ДНК образуют специфическое гало, с поврежденной – не образуют гало, плотные.
TUNEL
Анализ TUNEL является еще одним из наиболее распространенных методов оценки фрагментации ДНК спермы. Принцип TUNEL заключается в обозначении разрывов, присутствующих в ДНК дезоксинуклеотидами (обычно дезоксиуридин трифосфат, dUTP). dUTP может быть непосредственно конъюгирован с флуоресцентным красителем или меченые биотином. Флуоресценцию измеряют с помощью проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии.
Результаты выражают в соотношении поврежденных (зеленых) сперматозоидов к нормальным (синим) сперматозоидам. Данный метод анализа для определения фрагментации ДНК мы проводим в нашей клинике.
Важное исследование было опубликовано (Borges 2019), демонстрирующее как высокий уровень по сравнению с низким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов влияет на успешность программы ЭКО и качество эмбрионов.
В настоящем исследовании для оценки фрагментации ДНК сперматозоидов используют тест на дисперсию хроматина сперматозоидов (SCD). При оценке спермы 200 мужчин проводилась оценка на уровень фрагментации ДНК сперматозоидов с низким уровнем (<30% фрагментации ДНК) по сравнению с высоким уровнем (>30% фрагментации ДНК). Затем была проведена оценка результатов лечения бесплодия методом ЭКО между двумя группами.
- Показатель оплодотворения яйцеклеток был одинаков между двумя группами
- Количество эмбрионов высокого качества на 3-е сутки развития отличалось и был ниже при высокой степени фрагментации ДНК сперматозоидов (36,4% против 23,8%).
- Процент эмбрионов на стадии бластоцисты (уровень бластуляции) также был разным (56,2% против 39,0%), а качество эмбрионов на стадии 5-6 суток развития было ниже при высокой фрагментации ДНК сперматозоидов.
- Показатель имплантации эмбрионов был ниже при высокой фрагментации ДНК (46,0% против 33,2%)
- Прерывание беременности до 20 недель беременности было выше при высокой фрагментации ДНК (17,8% против 39,9%).
Согласно результатам данного исследования, показатель высокой фрагментации ДНК сперматозоидов влияет на снижение качества эмбрионов, снижение показателя имплантации и увеличение частоты прерывания беременности.
Какова клиническая польза теста на определение фрагментации ДНК?
Таким образом, степень и характер повреждения ДНК сперматозоидов может негативно повлиять на результаты лечения бесплодия, исходя из исследований, показывающих, что образцы от мужчин, которые испытывали трудности с зачатием, имеют значительно больше повреждений ДНК, чем образцы от фертильных мужчин. Поскольку дефекты спермы могут быть скрыты, тест SDF (sperm DNA fragmentation) может предоставить дополнительную информацию для оценки качества спермы у мужчин с неизвестной историей бесплодия.
Можно ли улучшить фрагментацию ДНК спермы?
Для уменьшения показателей фрагментации ДНК в случаях мужского бесплодия назначают антиоксиданты, устранение токсических привычек (курение, алкоголь, наркотики и т.п.), а также вредных факторов окружающей среды (воздействие пестицидов, загрязнения и т.п.), которые увеличивают оксидативный стресс в клетках. Прием антиоксидантов должен быть назначен врачом андрологом, требует понимания их влияния в каждом конкретном случае, добавления кофакторов, определенных микроэлементов и аминокислот, усиливающих поддержку клеток и снижающих уровень фрагментации ДНК. К наиболее действенным антиоксидантам относятся:
Убихинол (коэнзим Q10),
Ресвератрол (транс ресвератрол),
Омега 3, с обязательным сочетанием с природным ацетатом токоферолом (например, масло зародышей пшеницы),
Добавление цинка, витамина Д, L-карнитина, витамина С.
Во время программы ЭКО важно провести максимально точный и эффективный отбор сперматозоидов с помощью микрофлюидных чипов, чтобы использовать только сперматозоиды, генетический материал которых не поврежден.
References:
1.Ribas-Maynou J, Benet J. Single and Double Strand Sperm DNA Damage: Different Reproductive Effects on Male Fertility. Genes. 2019;10(2):105.
2. Borges E Jr, Zanetti BF, Setti AS, Braga DPAF, Provenza RR, Iaconelli AJr. Sperm DNA fragmentation is correlated with poor embryo development, lower implantation rate, and higher miscarriage rate in reproductive cycles of non–male factor infertility.
Fertil Steril; 2019 Sep; 112(3): 483-490. doi:10.1016/j.fertnstert.2019.
3. Oocyte ability to repair sperm DNA fragmentation: the impact of maternal age on intracytoplasmic sperm injection outcomes
Amanda Souza Setti 1, Daniela Paes de Almeida Ferreira Braga 2, Rodrigo Rosa Provenza 3, Assumpto Iaconelli Jr 2, Edson Borges Jr 2
