Зміст сторінки
Що таке фрагментація ДНК сперматозоїдів?
Фрагментація ДНК сперматозоїдів — це тип тесту на чоловічу фертильність, який вимірює кількість пошкодженої ДНК у зразку сперми.
Дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК) — це молекула, яка містить генетичну інформацію і використовується в розвитку та функціонуванні організмів, і присутня в усіх клітинах людини, крім еритроцитів.
У випадку сперматозоїда людини генетична інформація зберігається в голові, і щоб вміститися в такий маленький простір, потрібні складні механізми, які вимагають заміни одних молекул іншими (зокрема, гістони замінюються протаміном). Це призводить до високої конденсації ДНК, яку легко захистити та транспортувати.
В останні роки зростає інтерес до цілісності ДНК сперми та її впливу у випадках безпліддя, коли показники звичайної спермограми нормальні. Були зроблені спроби оцінювати цей параметр як новий метод для прогнозування чоловічої репродуктивної здатності та, разом із звичайним аналізом сперми (спермограмою), продовжити вивчення чоловічого фактору безпліддя.
Цілісність генетичного матеріалу сперматозоїдів вважається життєво необхідною для нормального запліднення, належного розвитку ембріона та успішної імплантації (прикріплення ембріону до слизової порожнини матки) розвитку вагітності як при природному заплідненні, так і при допоміжних репродуктивних технологіях (ДРТ). У всіх чоловіків є певні пошкодження ДНК сперми. Одноланцюгова пошкодження включає численні точки розриву в усіх областях геному, пов’язані з окислювальним (оксидативним) стресом, коли в репродуктивних умовах це може перешкоджати клінічній вагітності та, як наслідок, збільшенню часу до зачаття дитини. Навпаки, дволанцюгові розриви ДНК можуть бути пов’язані з відсутністю репарації ДНК у клітинному мейозі, сприяючи підвищеному ризику переривання вагітності, поганій якості ембріона та невдачі імплантації при лікуванні безпліддя [1].
Оксидативний стрес постійно відбувається в організмі людини і може пошкоджувати ДНК сперматозоїдів. Фактори навколишнього середовища (пластик, розчинники, консерванти, важкі метали) та спосіб життя (паління, надмірне вживання алкоголю, надмірне вживання кофеїну, психотропні препарати, сильний тривалий стрес) може виражено збільшувати рівень оксидативного стресу і відповідно збільшувати пошкодження (рівень фрагментації) ДНК чоловічих статевих клітин.
У цій статті ми розглянемо додаткові відомості про фрагментацію ДНК, як зрозуміти результати та чим вона відрізняється від інших тестів на фертильність.
Перевірка якості сперми.
Десятиліттями тестування чоловічої фертильності покладалося на базовий аналіз сперми, який вивчає концентрацію, морфологію та рухливість сперматозоїдів, тобто на спермограму. Тим не менш, близько 30% із 5 мільйонів чоловіків у США, які стикаються з безпліддям, досі не знають, чому вони безплідні. Аналіз сперми оцінює базові критерії, але не дає повної чи прогнозної оцінки чоловічої фертильності.
Сперматозоїди дуже малі, але вони несуть величезну кількість генетичної інформації до яйцеклітини. Хоча наше розуміння пошкодження ДНК сперми зросло, точна причина залишається невідомою. Одним із важливих зауважень є те, що кількість виявлених пошкоджень сперми не завжди корелює з результатами спермограми. Іншими словами, у вас може бути хороша спермограма, але мати місце значні пошкодження ДНК сперми.
Цікаво, що яйцеклітина має певну здатність відновлювати пошкоджену ДНК сперми під час запліднення. Проте вчені вважають, що поріг пошкодження ДНК може перевищувати здатність яйцеклітин до відновлення. Особливо у жіночому віці старше 40 років. [3].
Які бувають показники фрагментації ДНК?
a.) Від відмінного до хорошого (менше або дорівнює 15% DFI)
b.) Від хорошого до задовільного (більше 15% до менше 25% DFI)
c.) Задовільно погано (більше або дорівнює 25% до менше 50% DFI)
d.) Дуже погано (більше або дорівнює 50% DFI)
Рис.1. Одно- та дволанцюгові розриви ДНК
Які існують методи діагностики фрагментації сперми?
Аналіз структури хроматину сперми (SCSA)
Було розроблено багато тестів для визначення пошкодження ДНК сперми. Однак усі вони використовують дещо різні процедури та призводять до різних стандартів вимірювання. Тест SCSA передбачає обробку сперми хімічним барвником. Пошкоджена ДНК стає червоною, нормальна ДНК стає зеленою.
Рис.2 Метод SCSA, пошкоджена ДНК червоного кольору, непошкоджена – зеленого.
Після цього зразок пропускається через комп’ютеризовану машину зі спеціальним програмним забезпеченням, яке зчитує близько 5000 клітин сперми. Потім він класифікує співвідношення зелених і червоних сперматозоїдів, щоб визначити індекс фрагментації ДНК (DFI) . Цілком можливо, що тест SCSA може виявити пошкодження у 20% пар, у яких раніше не було пояснень безпліддя.
Тест на дисперсію хроматину сперматозоїдів (SCD)
SCD (sperm chromatin dispersion)— це простий і швидкий аналіз, який виявляє фрагментацію ДНК сперми; це може бути виконано без потреби у складному лабораторному обладнанні. Сперматозоїди за допомогою агарози прикріплюються до предметного скельця, інкубуються із кислотним розчином, який денатурує ДНК, а потім адаптованим лізуючим розчином, який видаляє більшість ядерних білків. Внаслідок цього петлі ДНК здорових сперматозоїдів утворюють ореали хроматину, а пошкоджені (фрагментовані) не виробляють ореолів.
Рис.3. Метод SCD, сперматозоїди з непошкодженою ДНК утворюють специфічне гало, з пошкодженою – не утворюють гало, є щільними.
TUNEL
Аналіз TUNEL є ще одним із найпоширеніших методів оцінки фрагментації ДНК сперми. Принцип TUNEL полягає в позначенні розривів, присутніх у ДНК, дезоксинуклеотидами (зазвичай дезоксиуридинтрифосфат, dUTP). dUTP може бути безпосередньо кон’югований з флуоресцентним барвником або мічений біотином. Флуоресценцію вимірюють за допомогою проточного цитометра або флуоресцентної мікроскопії.
Результати виражаються у відсотковому співвідношенні пошкоджених (зелених) сперматозоїдів до нормальних (синіх) сперматозоїдів. Даний метод аналізу на визначення фрагментації ДНК ми проводимо в нашій клініці.
Рис.4. Метод TUNEL, сперматозоїди з пошкодженою ДНК – зелені, з непошкодженою – сині.
Важливе дослідження було опубліковано (Borges 2019), яке демонструє як високий рівень в порівнянні з низьким рівнем фрагментаціі ДНК сперматозоідів впливає на успішність програми ЕКЗ і якість ембріонів. В цьому дослідженні для оцінки фрагментації ДНК сперматозоїдів використовується тест на дисперсію хроматину сперматозоїдів (SCD). При оцінці сперми 200 чоловіків, проводилася оцінка на рівень фрагментації ДНК сперматозоїдів із низьким рівнем (<30% фрагментації ДНК) в порівнянні з високим рівнем (>30% фрагментації ДНК). Потім відбулася оцінка результатів лікування безпліддя методом ЕКЗ між двома групами.
- Показник запліднення яйцеклітин був однаковим між двома групами
- Кількість ембріонів високої якості на 3-тю добу розвитку відрізнялася і була нижчою при високому ступені фрагментації ДНК сперматозоїдів (36,4% в порівнянні 23,8%)
- Відсоток ембріонів на стадії бластоцисти (рівень бластуляції) також був різним (56,2% в порівнянні з 39,0%), а якість ембріонів на стадії 5-6 доби розвитку була нижчою при високій фрагментації ДНК сперматозоїдів
- Показник імплантації ембріонів був нижчим при при високій фрагментації ДНК (46,0 % в порівнянні 33,2 %)
- Переривання вагітності до 20 тиж вагітності був вищим при високій фрагментації ДНК (17,8% в порівнянні 39,9%).
Як видно з данного дослідження показник високої фрагментації ДНК сперматозоїдів впливає на зниження якості ембріонів, зниження показника імплантації та збільшення частоти переривання вагітності.
Яка клінічна користь тесту на визначення фрагментації ДНК?
Таким чином, ступінь і характер пошкодження ДНК сперматозоїдів може негативно вплинути на результати лікування безпліддя, виходячи з досліджень, які показують, що зразки від чоловіків, які мали труднощі з зачаттям мають значно більше пошкоджень ДНК, ніж зразки від фертильних чоловіків. Оскільки дефекти сперми можуть бути прихованими, тест SDF (sperm DNA fragmentation) може надати додаткову інформацію для оцінки якості сперми у чоловіків з невідомою історією безпліддя.
Чи можна покращити фрагментацію ДНК сперми?
Для зменшення показників фрагментації ДНК у випадках чоловічого безпліддя призначають антиоксиданти, усунення токсичних звичок (паління, алкоголь, наркотики тощо), а також шкідливих факторів навколишнього середовища (вплив пестицидів, забруднення тощо), які збільшують оксидативний стрес в клітинах. Прийом антиоксидантів має бути призначений Вашим лікарем андрологом, вимагає розуміння їх впливу в кожному конкретному випадку, додавання кофакторів, певних мікроелементів та амінокислот, що посилюють підтримку клітин та знижують рівень фрагментації ДНК. До найбільш дієвих антиоксидантів відносяться:
Убіхінол (коензим Q10),
Ресвератрол (транс ресвератрол),
Омега 3, з обов’язковим поєднанням з природнім токоферолом ацетатом (наприклад, олія зародків пшениці),
Додавання цинку, вітаміну Д, L-карнітину.
Під час програми ЕКЗ важливо провести максимально точний і ефективний відбір сперматозоїдів, щоб використовувати лише ті сперматозоїди, генетичний матеріал яких не пошкоджено за допомогою: застосування мікрофлюїдних чіпів тощо.
Reference:
1.Ribas-Maynou J, Benet J. Single and Double Strand Sperm DNA Damage: Different Reproductive Effects on Male Fertility. Genes. 2019;10(2):105.
2. Borges E Jr, Zanetti BF, Setti AS, Braga DPAF, Provenza RR, Iaconelli AJr. Sperm DNA fragmentation is correlated with poor embryo development, lower implantation rate, and higher miscarriage rate in reproductive cycles of non–male factor infertility.
Fertil Steril; 2019 Sep; 112(3): 483-490. doi:10.1016/j.fertnstert.2019.
3. Oocyte ability to repair sperm DNA fragmentation: the impact of maternal age on intracytoplasmic sperm injection outcomes
